【一起读文献】The EMBO Journal：内质网中错误折叠蛋白到溶酶体降解的机制

   内质网（ER）中合成的蛋白质与-N-X-S/T序列中天门冬酰胺残基上预组装的低聚糖共价修饰 (图 1A）。在内质网α-葡萄糖苷酶I和II (GI和GII，图 1A)的作用下，相继去除葡萄糖残基1和2，产生一个单糖基化的中间体招募钙联蛋白(CNX) 。CNX是一种内质网凝集素伴侣，它帮助新合成的多肽折叠，并通过泛素蛋白酶体系统(UPS)保护它们免受ERAD的不必要的选择。有缺陷的多肽被它们的N-连接的寡糖广泛地去甘露糖基化，去除浅绿色甘露糖残基（图 1A）。这样导致两个后果：首先，去除甘露糖A(图 1A)消除了低聚糖分支A通过ER质量控制因子UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖转移酶(UGGT1，图 1A)重新糖基化的受体。这防止了单糖化N-聚糖的产生，并不可逆转地从CNX伴侣系统中提取非天然多肽。其次，它与内质网凝集素结合，结合显示墨绿色末端甘露糖的N-连接寡糖(图1A)。这些甘露糖结合凝集素(OS-9和XTP3-B)将错误折叠的多肽穿插到E3泛素连接酶周围的超分子复合物中。这促进了末端错误折叠的多肽穿过内质网膜，从而被胞浆蛋白酶体(ERAD)降解。不能跨ER膜进行ERAD的错误折叠蛋白被分离在特定的ER亚域中，在膜上显示ER-吞噬受体。包括FAM134B在内的ER-吞噬受体在额外因素的推动下，从ER中切断这些ER亚域，并招募精选的细胞质自噬基因产物。大约95%的α-1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏患者表现为SERPINA1基因的Z突变，AAT缺乏是一种肺和肝脏疾病。Z突变导致编码α-1抗胰蛋白酶-Z(ATZ)的Glu₃₄₂Lys被替换。错误折叠的ATZ被移位到内质网的膜上，以降解蛋白酶体。作者和其他团队最近确认FAM134B是与LC3结合的ER噬菌体受体，它调节哺乳动物或酵母细胞中含有耐ERAD错误折叠蛋白的ER部分的移除。与本研究相关的是，耐ERAD的ATZ聚合物被分离在富含FAM134B的ER亚域中。这些囊泡和内质网衍生的囊泡在SNARS Synaxin17和VAMP8的控制下，直接在LAMP1/RAB7阳性的内溶酶体中释放其内容物。错误折叠的前胶原在FAM134B阳性的ER来源的囊泡中也被分离，但这些囊泡首先被自噬体捕获，然后与内溶酶体融合。令人费解的是，CNX是ER-吞噬受体FAM134B的主要相互作用因子，它是一种内质网驻留凝集素，可以保护错误折叠的N-糖基化多肽免受蛋白酶体降解。CNX缺失显著抑制了FAM134B驱动的通过LC3依赖的囊泡运输的ATZ聚合物的ERLAD，以及FAM134B驱动的错误折叠的前胶原蛋白的ERLAD。

野生型AAT蛋白和致病的ATZ变异体在天冬酰胺残基的N46、N83和N247位显示3个N-糖链 (图 1B、AAT_NNN和ATZ_NNN)。Z突变促进了耐ERAD聚合物的形成，这些聚合物被运送到哺乳动物和酵母细胞中的溶酶体进行清除。ATZ_NNN聚合物是由单克隆抗体2C1识别的。它们从内质网运输到降解的内溶酶体隔室，在抑制溶酶体水解酶的情况下积聚。在非变性凝胶中Halotag标记的AAT_NNN和ATZ_NNN的分离证实了后者有更高的聚合倾向 (图1C），通道2与通道1和通道5与通道4)。作者团队通过HaloTag脉冲追踪技术在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中监测了AAT_NNN和ATZ_NNN，在共聚焦激光扫描显微镜下对荧光标记蛋白在细胞内的运输进行时间分辨分析。表达Halo-AAT_NNN(图 1D)或Halo-ATZ_NNN(图 1E)的细胞不久就与“黑色配体”6-氯己醇孵育，占据HaloTag的配体结合位置。随后，细胞与细胞通透性HaloTag荧光配体JF646(新合成的Halo-AAT_NNN或Halo-ATZ_NNN的荧光脉冲)孵育。15分钟后，JF646被“黑色配体”7-溴庚醇取代，停止荧光渗入，并开始0、2、4或6小时的追踪 (图 1D-F)。在追踪过程中，将巴佛洛霉素A1(BafA1)添加到细胞培养液中，以确保用于溶酶体清除的荧光标记蛋白在LAMP1阳性隔室内积累。15分钟脉冲产生一群荧光Halo-AAT_NNN(图 1D，Halo 0h示踪)或Halo-ATZ_NNN(图 1E，Halo 0h示踪)。图像分析和LysoQuant无偏量化，显示只有Halo-ATZ_NNN在LAMP1阳性的内溶酶体内显著和渐进性积累(图1E，图1F定量，0至6h追踪)。这与分泌蛋白AAT_NNN能有效地从细胞中释放的事实相一致，而部分ATZ_NNN进入聚合物保留在细胞内，最终被溶酶体酶清除(图2B)。

图1. N-聚糖加工和ATZ_NNN输送到内溶酶体

作者团队通过对野生型MEF激光共聚焦拍摄，报道了带有抗HA抗体 (图2A，HA/LAMP1，图2H)和2C1抗体(图 2A，2C1/LAMP1，图 2I)在LAMP1阳性的内溶酶体中传递HA标记的ATZ_NNN聚合物，其中ATZ_NNN在BafA1水解酶失活时积聚。一致地，细胞暴露于BafA1大大推迟了2C1阳性聚合物的清除 (图 2B)。在缺乏ER吞噬受体FAM134B的MEF (图 EV1A，通道1-2)中，在LAMP1阳性降解隔室内ATZ_NNN聚合物的传递是有缺陷的(图EV1B和E，表达HA标记的ATZ_NNN的细胞和模拟转染空pcDNA3质粒的细胞)。免疫共沉淀试验证实FAM134B和FAM134B LIR确实与CNX (图 EV1F，Co-IP，通道4和5，上列）以及ERLAD ATZ_NNN(Co-IP，通道4和5，中列)结合。然而，只有FAM134B与LC3(Co-IP，通道4和5，下列)结合，这是形成含有聚合物的ER衍生囊泡并将其输送到降解内溶酶体区域所必需的(图 EV1C-E）。这些结果表明，FAM134B 是溶酶体清除 ER 中产生的 ATZ_NNN 聚合物所必需的。

图2. CNX和N-聚糖加工在将ATZ_NNN输送到内溶酶体中的作用

N-连接寡糖的N-糖基化和加工（GI 和 GII 的去糖基化，UGGT1 的再糖基化，aMI 和 EDEM 蛋白的去甘露糖基化）（图 1A）是 ER 蛋白质质量控制中的关键过程。它们提高了未折叠的新生链在拥挤的ER环境中的溶解度，并决定了它们在CNX伴侣系统中的进出与保留。与CNX的结合促进了结构成熟并保护未折叠的多肽免受ERAD的不必要选择。2C1免疫活性ATZ_NNN聚合物的形成不需要凝集素伴侣CNX (图 2C，2C1列)。然而，在CNX-KO MEF中，降解的LAMP1阳性隔室内ATZ_NNN聚合物的清除能力大大减弱 (图 2C，2C1/LAMP1，图 2H和I)。这些数据证实，将错误折叠的多肽从内质网运送到内溶酶体区域(即ERLAD)需要CNX联合。

进一步的实验表明，糖链加工的药理调节对ERLAD和ERAD通路有不同的影响。例如，在暴露于KIF的细胞中，ATZ_NNN聚合物的溶酶体输送不受影响 (图2D、H和I)。因此，从N-聚糖中去除甘露糖，即ERAD的有效触发因素，对ERLAD来说是非必要的。同样，CST抑制了糖蛋白与CNX的结合，大大加速了ERAD，减少了用于溶酶体递送的耐ERAD  ATZ_NNN聚合物的选择 (图2E和H以及图I)。值得注意的是，在表达短CNX变异体的细胞中，ATZ_NNN的溶酶体递送是有缺陷的 (图2F和H和I)。sCNX保留跨膜和胞质结构域，确保与FAM134B形成功能复合物。然而，它的特征是在碱基307-725之间剪接，对应于多肽链中104-242位残基的缺失。该缺失去除了对CNX的凝集素功能至关重要的D118、C161、Y165、K167、Y186、M189、C195、E217。因此，CNX：FAM134B复合物将物质递送到内溶酶体进行清除时需要FAM134B的LIR功能(图 EV1B-E)和CNX的葡萄糖结合功能 (图 2A、C、E、F、H、I、J、K和M)。

新合成的蛋白质通过GI和GII依次去除最外层的两个葡萄糖残基而生成的单糖化低聚糖与CNX结合 (图 1A，细箭头)。执行折叠程序之后，GII除去葡萄糖3 (图 1A，粗箭头)，从CNX释放，并在细胞内或细胞外活性位点转运天然多肽。由GII介导的脱糖(图1A，粗箭头)的重复循环延迟了非天然蛋白如ATZ_NNN从CNX中的释放，随后ER质量控制因子UGGT1立即进行了葡萄糖基化（图 1A，弯曲箭头）。这可以在删除UGGT1后被禁用，从而总体上减少了CNX的参与。在Uggt1-KO MEF中，ATZ_NNN聚合物没有被输送到内溶酶体隔室 (图 2G-J和M)。溶酶体递送在反向转染具有催化活性的UGGT1 (图 2K和M)时得到挽救，但当细胞被UGGT1 (图 2L和M)的突变形式补充时就不能拯救溶酶体递送，UGGT1的突变形式由于缺乏活性位点的₁₄₅₂DQDLPN₁₄₅₇残基而不能重新糖基化错误折叠的蛋白。这些实验表明，UGGT1的催化活性是ATZ_NNN聚合物溶酶体转运所必需的，这意味着ERLAD的选择需要多次脱糖/再糖基化循环和CNX的持续保留。

HaloTag脉冲追踪实验显示，在暴露于BafA1的WT MEF中，荧光标记的聚合的Halo-ATZ_NNN逐渐积聚在LAMP1阳性的、不活跃的内溶酶体中(图1E，6h 追踪，图 1F)。如果在没有BafA1的情况下进行同样的实验，ATZ_NNN的荧光卤素标记聚合物一旦被送到LAMP1阳性降解隔室内就会被降解，而不是积累在它们的管腔内 (图 EV4F)。在这些细胞中，单体Halo-ATZ_NNN被ERAD降解，聚合物Halo-ATZ_NNN被ERLAD降解，标记蛋白从细胞中完全消失 (图 EV4F，0-6h追踪)。

在缺乏CNX (图 EV4G)或UGGT1(图 EV4H)的细胞中，在45分钟荧光脉冲期间标记的Halo标记的ATZ_NNN部分(在Halo/LAMP1中为红色)保留在内质网中，在那里它与Bip(Halo/Bip)广泛共存。在ERLAD失活的CNX-或Uggt1-KO细胞中表达的ATZ_NNN更容易进入洗涤剂不溶的部分，在8M尿素中溶解时从洗涤剂不溶的部分中提取ATZ_NNN  (图 EV4I，通道2和3)。

图EV4.  FAM134B:CNX: ATZ_NNN复合物和ATZ聚合物的细胞内定位

   作者团队为了明确评估N-链低聚糖在ERLAD物质选择中的作用，监测了由N-聚糖受体天冬酰胺残基(N)第46、83和247位突变为谷氨酰胺(Q)所产生的全系列ATZ_NNN糖基化突变体的细胞内命运 (图 3A)。所有8个糖基化变异体都形成2C1-免疫反应聚合物，如共聚焦激光扫描显微镜分析(图 3B-I，2C1)、流式细胞仪和天然凝胶(图 EV2C-D)和免疫分离(图 4A和B)所示。即(ATZ_NNN(图3B和J，以及K)、ATZ_NNQ(图3C、J、K)、ATZ_QNN(图3E、J、K)、ATZ_QNQ(图3G、J、K))。缺少这种低聚糖的变体(即ATZ_NQN(图3D、J、K)，ATZ_NQQ(图3F、J、K)，ATZ_QQN(图3H、J、K)，以及ATZ_QQQ(图3I-K))在溶酶体隔间内递送效率非常低。因此，第83位的寡糖是其修饰标记为ATZ的N-多糖，用于溶酶体输送。这些数据在多种瞬时或稳定表达模型蛋白的细胞系中得到证实，包括人胚胎肾细胞(HEK293，图 EV5A-E)、小鼠肝细胞(HEPA1-6，图 EV5F-J)、人HeLa细胞(图 EV5K-O)和小鼠3T3细胞(见图 4G-J)。唯一值得注意的例外是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中ATZNNN不在lamp1阳性的内溶酶体中传递(图 EV5P)。最近的研究表明，BafA1对CHO细胞中可溶性ATZ聚合物的清除没有影响，并报道了该物种在洗涤剂不溶性颗粒中的大量沉积。我们在CHO细胞中解释CHO细胞中ATZ聚合物从内质网到内溶酶体的运输缺陷的原因，但我们认为这一发现值得报道，因为CHO细胞广泛应用于细胞生物学实验室，包括那些研究ATZ生物学的实验室。数据显示，对于Pro和Rro-Col2A1的R989C形式，1388位的蛋白结合低聚糖的消除大大损害了LEV3A)的清除(图 EV3B-F)，从而加强了n-聚糖作为溶酶体传递的相关性。这些数据在多种瞬时或稳定表达模型蛋白的细胞系中得到证实，包括人胚胎肾细胞(HEK293，图 EV5A-E)、小鼠肝细胞(HEPA1-6，图 EV5F-J)、人HeLa细胞(图 EV5K-O)和小鼠3T3细胞(见图 4G-J)。唯一值得注意的例外是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中ATZNNN不在LAMP1阳性的内溶酶体中传递(图 EV5P)。最近的研究表明，BafA1对CHO细胞中可溶性ATZ聚合物的清除没有影响，并报道了该物种在洗涤剂不溶性颗粒中的大量沉积。我们在CHO细胞中解释CHO细胞中ATZ聚合物从内质网到内溶酶体的运输缺陷的原因，但我们认为这一发现值得报道，因为CHO细胞广泛应用于细胞生物学实验室，包括那些研究ATZ生物学的实验室。数据显示，对于Pro和Rro-Col2A1的R989C形式，1388位的蛋白结合低聚糖的消除大大损害了LEV3A)的清除(图 EV3B-F)，从而加强了n-聚糖作为溶酶体传递的相关性。  

接下来，作者团队选择了两个ERLAD敏感的ATZ(ATZ_NNN和ATZ_QNQ)和两个耐ERLAD的ATZ变异体(ATZ_QQN和ATZ_QQQ)来监测聚合物的命运和伴侣关系 (图 4）。用³⁵S蛋氨酸和半胱氨酸代谢性标记表达单个模型蛋白的细胞，并追踪10、120和240min。在每个追踪时间结束时，分别从含有抗HA (图 4A，IP：HA)或聚合物特异性的2C1抗体(IP：2C1)的洗涤剂裂解液中免疫分离放射性标记的ATZ_XXX和ATZ_XXX聚合物的剩余群体。对于ERLAD敏感变异体，放射性标记聚合物在合成后120分钟达到峰值(ATZ_NNN和ATZ_QNQ，图 4A，IP：2C1，分别为1-3和4-6道，图 4B)。它们在较长追踪时间(图4A，通道3和6，图 4B)中的消失归因于它们的溶酶体传递和清除(图 3B、G、J、K)。相比之下，ERLAD功能不强的ATZ_QQN和ATZ_QQQ聚合物没有被送到内溶酶体区域进行清除 (图 3H-K)，在追逐时间内积累(图 4A，通道7-9和10-12，图 4B)。

作者团队通过免疫分离ATZ与相关的分子伴侣的进一步分析表明，由于凝集素伴侣参与其溶酶体递送的选择，两个ERLAD底物ATZ_NNN和ATZ_QNQ如预期的那样与CNX充分结合(图 4C，Co-IP，上图，通道2，3，图 4D)。相比之下，两个耐ERLAD的变异体ATZ_QQN和ATZ_QQQ的表现很差(图4C，Co-IP，上图，通道4，5和图 4D)。相反，ATZ_QQN和ATZ_QQQ与BIP结合得更多(图 4C，Co-IP，下图，通道4，5，图 4E)。

综上所述，在具有活性ERLAD的细胞中(WT MEF，图 EV4B，通道1-3)，ERLAD中的ATZ_NNN与CNX大量关联(图 EV4B，Co-IP，上图，通道2)。耐ERLAD的ATZ_QQQ与Bip(Co-IP，下图，通道3)密切相关。在具有非活性ERLAD的细胞中(Uggt1-KO MEF，图 EV4B，通道4，6)，ATZ_NNN与CNX的关联显著降低(Co-IP，上图，通道5与通道2)，并且与BiP的关联增强(Co-IP，下图，通道5与通道2)。这些数据进一步支持这样的观点，即与CNX的结合在ERLAD途径中对耐ERAD多肽的传导起着至关重要的作用，并可能揭示Bip对那些无法进入ERLAD途径的错误折叠多肽的内质网保留的作用。

在没有BafA1的情况下，共聚焦激光扫描显微镜监测了ERLAD活性和ERLAD非活性ATZ糖基化变异体在细胞内的不同表现。在这些实验条件下，ATZ_NNN聚合物一旦进入LAMP1阳性的内溶酶体就会被降解(图EV 4F)。因此，在稳态时，ATZ_NNN主要位于内质网，在那里合成ATZ_NNN，并与ER伴侣CNX(图 4G)和Bip(图 4H)共定位。相反，ATZ_QQQ在生物合成室中可以看到，但它也聚集在排除CNX(图 4I)的大簇中，并与Bip共定位。

图EV4F-H中所示的相同的HaloTag脉冲追踪方法进一步证实了这一点(即在没有BafA1的情况下执行)。简而言之，表达Halo-ATZ_NNN或Halo-ATZ_QQQ(图 4K、L)的细胞与细胞可渗透的HaloTag荧光配体JF646孵育。45分钟后，JF646被“黑色配体”7-溴庚醇取代，停止荧光渗入。荧光Halo-ATZ_NNN在24小时内逐渐从细胞中消失，与其有效的溶酶体清除一致(图 4K，灰度级，另见图EV4F)。在追踪24小时期间，细胞内斑点中的荧光HaloATZ_QQQ簇(图 4L，灰度级)，对ATZ_QQQ簇(红色，图 4L)的表征表明，它们形成在LAMP1阳性内溶酶体(图 4L，Halo/LAMP)之外，并与Bip(图4L，箭头)共定位。因此，在缺乏功能性CNX或功能性葡萄糖苷酶和糖基转移酶（图 2C、E-G、J，EV1B和图 EV3H、J-L，EV4D-E，G，H）的ERLAD功能不全的细胞中表达的ERLAD客户，或缺乏ERLAD选择所需的n -聚糖（图3D、F、H、I、4I、J、L、EV3C、E、EV5C、D、H、I、M、N）的ERLAD客户，不能被运送到溶酶体室进行清除，更容易形成不溶性的细胞内沉积物。

内质网是蛋白质合成的场所。折叠功能不全和末端错误折叠的多肽具有高度不同的结构、大小、修饰和理化性质，涉及多种客户、细胞、组织特异性和一般途径，最终被从生物合成间隔室中移除和降解。其中很大一部分是通过围绕膜嵌入的E3泛素连接酶建立的专门转位机制，穿过内质网膜，由胞浆泛素/蛋白酶体系统在分解代谢过程中降解，统称为ER相关降解(ERAD，图5上部)。内质网还会产生错误折叠的多肽，这些多肽无法与ERAD机制接触。较大的尺寸或聚集/聚合倾向通常会阻止跨ER膜的移位，并激活替代的分解代谢途径，这些途径与ER吞噬机制的组件相结合。内质网吞噬程序由多效性或以内质网为中心的信号激活，这些信号导致细胞吞噬自己的内质网以获得营养，控制内质网的大小和功能，或者像错误折叠的蛋白质那样，移除含有内质网部分。在一系列内质网吞噬受体的控制下，部分内质网囊泡化，并被运送到内溶酶体隔室进行清除。在内质网到溶酶体相关降解(ERLAD)的情况下，从生物合成室分离的内质网部分含有抗ERAD的错误折叠多肽，这些多肽通过依赖LC3的囊泡运输、宏观和微观内质网吞噬(ERLAD，图5中的下部)被输送给溶酶体降解。

图5. 错误折叠的多肽进行蛋白酶体（ERAD）或内溶酶体降解（ERLAD)的选择

       N-聚糖在蛋白质质量控制中起了关键作用，它们的定位决定了它们由内质网驻留的葡聚糖酶处理，它们通过编码信号将蛋白质释放到分泌ERAD或ERLAD途径中。特定的凝集素必须对信号进行解码，以确保适当的辅助折叠(成熟的、可供分泌的)、折叠(未成熟的，保留在折叠环境中)或最终错误折叠的多肽(由蛋白酶体或溶酶体清除)。了解N-糖基化和N-连接多糖的加工如何决定多肽的命运，可以通过药物/遗传干预来增加功能性蛋白的合成，或优化蛋白酶体(通过ERAD)或溶酶体(通过ERLAD)去除缺陷蛋白。

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Fregno I, Fasana E, Soldà T, Galli C, Molinari M. N-glycan processing selects ERAD-resistant misfolded proteins for ER-to-lysosome-associated degradation. EMBO J. 2021 Aug 2;40(15):e107240. 

  编译    王永香

  校审    李胜男